IPS诱导肠类器官的培养过程可以分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层的分化以及中/后肠模式的诱导和类器官的培养。本文将重点介绍第三阶段——类器官培养。

一、类器官培养准备工作

在类器官培养过程中，需要准备以下试剂和耗材：人正常肠类器官培养试剂盒（abs9545）、低因子无酚红基质胶（abs9495）、15ml离心管（abs7102）、15ml EP管若干（abs7119）、24孔细胞培养板（abs7035）和金属冰盒。

类器官培养基组成

• 类器官培养基 A：100ml
• 类器官原代培养缓冲液 B：250ml
• 原代组织消化液 C：30ml
• 类器官传代消化液 D：30ml
• 组织保存液 E：100ml
• 类器官冻存液 F：20ml
• 类器官传代培养缓冲液 G：250ml

二、操作流程

1. 加胶-点板-加液

本环节是原代操作中至关重要的步骤：

1. 准备阶段：
   • 基质胶需在4℃的金属冰盒中过夜融化。
   • 枪头和离心管需在-20℃下预冷至少半小时。
   • 融化后的基质胶应在4℃下保存，建议在两周内用完。
2. 接种要求：使用24孔板（abs7035），每孔添加25μL基质胶球状体混合物，及500-750μL类器官培养基。
3. 接种密度：建议基质胶总体积与球状体总体积的比例为25:1，或是50个球状体/25μL基质胶。
4. 在冰上进行加胶和混合操作，以控制在半分钟内完成，以保持基质胶的流畅性。
5. 将培养板放入37℃培养箱中40-60分钟使基质胶凝固，然后添加500-750μL类器官培养基 A 进行培养。约10-14天后，类器官直径可达200μm-500μm，可进行传代操作。

2. 传代操作

对于类器官数量较多或体积较大的情况，传代步骤如下：

1. 类器官的收集与洗涤：
   1. 使用移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml的4℃类器官传代培养缓冲液 G，轻轻吹散基质胶，收集入15ml离心管中。
   2. 用类器官传代培养缓冲液 G 定容至14ml，静置于4℃40分钟或-20℃5分钟以软化基质胶。
   3. 经过300g，4℃离心5分钟，待分层后弃去上清和基质胶层，保留类器官沉淀。
2. 消化步骤：
   1. 将2-3mL类器官传代消化液 D 添加至超净台内，消化2-3分钟。
   2. 然后添加5倍于消化液的类器官传代培养缓冲液 G，终止消化，离心处理。
3. 进行再接种：
   1. 在24孔板中，每孔添加25μL基质胶混合物和500-750μL类器官培养液。
   2. 密度建议控制为500个类器官/25μL基质胶，保证适当的细胞聚集。

三、冻存及复苏

类器官在指数增长期进行冻存，以保证复苏后的活率。冻存步骤包括类器官的收集、洗涤以及在梯度冻存中的操作：

1. 收集并洗涤类器官：
2. 快速将冻存管放入37℃水浴解冻，并添加类器官传代培养缓冲液 G 重新悬浮。
3. 轻柔混合后进行离心，最后加胶、点板、加液，根据上述接种要求进行操作。

加强对基质胶的控制和细胞培养环境的优化，才能有效促进类器官的稳定生长和功能实现。通过严格遵循以上步骤并优化各个细节，能够有效地生成功能性人类肠道类器官，助力于疾病建模与药物筛选等生物医疗研究。对于更多的产品和试剂请访问环亚集团·AG88，了解我们最新的生物研究解决方案与产品。